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ファージディスプレー法による…from Creative Biolabs社

シングルドメイン (ナノボディー) 抗体とは

ドメイン抗体、VHH、VNAR、sdAbとしても知られているシングルドメイン抗体は、単一の可変分子可変ドメインからなり、従来のFab領域の重鎖の軽鎖およびCHドメインを欠く一種の抗体フラグメントです。初期のシングルドメイン抗体は、ラクダ科動物 (例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど)で同定された重鎖抗体のVHHドメインから作製されました。また、軟骨魚類 (例えばサメ)重鎖抗体 (IgNAR 免疫グロブリン新規抗原受容体として知られる)のVNARドメインは、sdAb産生のための別の供給源となります。別のアプローチとして、いくつかの重要な残基をラクダ化することによって、ヒトやマウスの正常IgGからの二量体可変ドメインを単量体に分割することがあります。

シングルドメイン -ナノボディ- 抗体作製

概要 | 特長

◆概要

CreativeBioLabs社は、シングルドメイン抗体ライブラリー分野でのリーディングカンパニーです。ユニークで幅広い同社のサービスは、ラマおよびラクダを使用することによる免疫シングルドメイン抗体ライブラリーの構築、DNA合成を使用することによる合成ラクダ化ヒトシングルドメイン抗体ライブラリーの構築、シングルドメイン抗体ライブラリーのバイオパニングおよび組替えシングルドメイン抗体のラージスケール産生を可能としました。

Fig. The comparison among single domain antibody and other types of antibody.

一般的な抗体(上図A)は、2本の軽鎖と2本の重鎖からなり、軽鎖と重鎖は免疫グロブリンドメインにより構成され、軽鎖は2つ(VL、CL)、重鎖は4つ(VH, CH1, CH2, CH3)のドメインからできています。1993年Hamers-Castermanらが、ラクダ科動物の血中に重鎖のみによる抗体(重鎖抗体:Heavy-chain antibody 上図B)が多量に存在することを発見し、このラクダ抗体のVHドメイン (上図E)を、ナノボディまたはVariable domain of a heavy chain antibody(VHH)抗体といいます。このナノボディが発見されるまで、抗体を利用した最小抗原認識分子は、VH、VLの2つのドメインをリンカーで結合させた一本鎖抗体(scFv: single chain Fv 上図D)でした。

◆特長

    • ファージディスプレイ法
      大腸菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ粒子表面に、タンパク質やペプチドを別の分子と相互作用できる形で提示させる方法である。また、提示された分子の遺伝子情報はファージ内のDNAに組み込まれているため、容易に提示分子の構造情報を入手できるという利点を有している。
      詳細はこちらのメーカーサイトをご覧ください。
    • sdAb (VHH抗体・ナノボディ)の特長として、CDR3領域が通常のIgG抗体と比べ長い
      一般的なIgG抗体は、VHとVLの6箇所のCDR領域で抗原結合領域となっているが、重鎖抗体由来のVHH抗体の場合、3箇所のCDR領域で抗原と結合する。VHH抗体のCDR領域は一般的な抗体の約3倍の長さである。
    • 生産が容易
      分子量が約15KDaで、大腸菌のような微生物発現系で容易に発現が可能。scFvやFabはVHドメインとVLドメインをリンカーでつなぐ必要があるがVHH抗体ではVLドメインがないため、他のフラグメント抗体に比べ発現効率が高い。
    • 安定性が高い
      sdAb (VHH抗体・ナノボディ)は、様々な劣悪な条件下(高温、高圧など)において天然の構造へ巻き戻りやすい性質(可逆性)を持つ。また、90℃という高温にも耐えることが可能。
    • 免疫ライブラリー
      特定の疾患や感染症に羅患した患者や、標的の抗原を免疫して抗体価を上昇させた免疫動物のリンパ球由来の抗体遺伝子を用いる。免疫ライブラリーは、抗原結合力の強い抗体を得ることができるが、多様性に乏しい。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからも目的の抗体を得ることが可能。この方法では、それぞれの抗原ごとにライブラリーを作製する必要がある。
    • ナイーブライブラリー
      免疫をしていない動物もしくは健常者由来のリンパ球を用いる。
      ナイーブライブラリーは、抗体遺伝子に偏りのない多様性に富んだ抗体ライブラリーを獲得できる可能性が高いが、抗原結合力が弱くなる。免疫作業を必要としないため、自己抗原に対する抗体作製が可能。ナイーブライブラリーは免疫ライブラリーとは異なり抗原特異的なクローンが少ないので、抗体の多様性が必須であることから大規模なライブラリーを構築する必要がある。

  • アフィニティマチュレーション (Affinitymaturation:親和性成熟)
    抗原による刺激を繰り返し行うことで、抗原に対してより強く反応する(親和性が高い)抗体を産生すること。免疫ライブラリーでは、上述したように抗原結合力の強い抗体が得られるため、アフィニティマチュレーションは必要としないが、ナイーブライブラリーの場合は本操作が必要となることがある。
    詳細はこちらのメーカーサイトをご覧ください。
    より高感度なモノクロ抗体作製

スケジュールと料金

概要 | PDによるsdAbライブラリ作製 | スケジュール | PDライブラリスクリーニング | sdAb作製

シングルドメイン抗体 (VHH・ナノボディー抗体) 作製スケジュールと料金 (全て参考価格ですので見積りをご用命ください。)

Creative Biolabs社は、ファージディスプレイ技術に基づくラマおよびラクダシングルドメイン抗体ライブラリーの構築のための比類ない能力を持っています。ナイーブライブラリーと比較して、免疫ライブラリーは、in vitroでの抗体親和性成熟の時間消費を回避することができ、よりよい抗体を産生できます。それらは、親和性の問題による有用性以前に、ナイーブライブラリーからの抗体は、頻繁に親和性成熟が必要です。また、1-100億の独立したクローンのサイズを必要とするナイーブライブラリーと比較して、免疫ライブラリーは、はるかに小さくすることができます。我々の経験では、1-1千万変異体の大きさの免疫ライブラリーは、優れた抗体を産生することがわかっています。我々は、ファージディスプレイベクターへの免疫ラマおよびラクダの形質細胞からのシングルドメイン抗体でのクローン作成の豊富な経験を持っています。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応により、1千万-1億個のクローンを含むシングルドメイン抗体のライブラリーは、定期的に生産されます。

◆ファージディスプレイシングルドメイン抗体ライブラリーの作製

ラマ/ラクダVHH抗体ライブラリーの作製[size: n×108]

サービス内容 数量 期間 参考価格
動物免疫 1 2-3 months 1,070,000
リンパ球分離、RNA回収およびcDNA合成 TDB 1 week 600,000
PCR増幅 (VHH遺伝子の増幅) Multiple 1 week 800,000
ファージミドベクターへのライゲーションおよび形質転換 1 2 weeks 740,000
ライブラリー検証 1 1 week
Total* 3,210,000

※ファージミドベクターpCDisplay-2を使用 (下記)。エレクトロポレーションによって大腸菌TG1に形質転換。
※M13K07をヘルパーファージとして使用
※各ステップで必要な費用の80%を、そのステップ開始時点でお支払頂きます (返金不可)。残りの20%に関しては成功報酬です。

pCDisplay-2 vector
Cat.No.: VPT4021
Vector type: phargemid vector
Vector length: 4612bp
Host: TG1
Tag: His6,Myc
Promotor: M13,ColE
Resistance: Amp

◆免疫スケジュール

INJECTIONS Inject 1mg CFA Day: 0
Inject 1mg IFA Day: 21
Inject 1mg CFA Day: 42
Inject 1mg IFA Day: 63
BLEEDS Pre Bleed Day: 0
Test Bleed Day: 52
Production Bleed Day: 73
PI to determine continuation of project Day: 84

◆ファージディスプレイライブラリースクリーニング

(パニングとレスキューイング)

サービス内容 期間 価格
ターゲット確認 SDS-PAGEなど 1 week 見積
抗体ライブラリースクリーニング 標的タンパク質に特異的なファージの濃縮 (1-10nM以上)のため、バイオパニングを4ラウンド行う 2 weeks
結合ファージの確認
(少なくとも20-30の目的のクローンが同定されるまで約100クローンを検証)
ファージ増幅[5,700/clone] 4 weeks
ターゲットに対するファージELISA[3,000/clone]
ファージDNA抽出[3,000/clone]
ファージDNAシーケンス[3,000/clone]
抗体確認 ファージウィルス形式の各抗体[20-30clones]は可溶性抗体の形式[phage-free]中で発現。抗原に対する抗体の結合性はELISAによって確認。 1 week
納品 12 weeks
Total* 5,900,000

◆シングルドメイン抗体作製

サービス内容 期間 価格
パイロットVHH発現および精製 遺伝子合成 1week 見積
ベクター構築 1week
初期アセスメント 1week
1mgの精製タグVHH抗体もしくは2LスケールのCHO-s TGE産物の精製 2weeks
Total* 400,000

※コドン最適化されたVHHのcDNAを合成
※当社が所有しているVHH発現ベクターへのcDNAのクローニング
※テストとして1mgのVHHをパイロットVHH発現および精製
※納品:活性が確認された1mgの精製VHH(もしくは1LスケールのCHO-s TGE産物)
※価格は為替により安くなる場合もあります。ライセンス料金が必要な場合もあります。必ず見積もりを要請ください。

scFv構築

ハイブリドーマセルラインのシーケンシングから発現ベクター構築
例1) scFv製造 – ハイブリドーマセルラインのシーケンシングからの発現ベクターまで
以下の価格はすべて参考価格です。ライセンス事案の場合等、都度見積もりをお出しいたします。

  1. Vh and Vl sequencing from hybridoma cell line
    We charge 350,000円 to sequence the Vh and Vl region from hybridoma cell line.
  2. Construction of the scFv expression construct
    We charge 205,000円/ea to construct an expression vector for the scFv antibody, covering below process:

    • Gene synthesis plus codon optimization, there are two genes, Vh and Vl, 3,000円/ea, 58,000円 in total
    • Design and construct the scFv construct. Please note that there are two different orientations for one scFv antibody as below. It’s hard to predict which one works better. And it’s even possible that one orientation is no longer functional. We highly recommend to try both orientations. For each orientation construct, the price is 73,000円.
      • N’-Vh-linker-Vl-C’
      • N’-Vl-linker-Vh-N’
    • Clone the scFv construct into the expression vector. Validate the gene by DNA sequencing. 80,000円/ea.

In summary, if you want to get both scFv constructs with different orientations, the sum is 350,000円. We just charge for the gene synthesis for once. If you want just one scFv construct, please assign the orientation and your price is 205,000円.

ライブラリー料金表

  • ①ご自分でsdAb (VHH・ナノボディー)ライブラリーを作製されたい方: 480,000~
    抗原 (ペプチド-ビオチン化、蛋白質、低分子化合物―コンジュゲート)を供給いただき、ラマ、ラクダへ免疫、その後、血液300mlからのリンパ球と抗血清を供給します。【サービス休止中】
  • ②ファージディスプレー法によるsdAb (VHH・ナノボディー)ライブラリー作製: 3,300,000
    抗原 (ペプチド-ビオチン化、蛋白質、低分子化合物―コンジュゲート)を供給いただき、ラマ、ラクダへ免疫、その後、採血、リンパ球抽出、抗原-リンパ球コレクション、mRNA抽出、RT-PCRによるcDNA合成、ナノボディー遺伝子特異的プライマーによるPCR、ファージベクターへのライゲーション、ライブラリー作製
  • ③ファージディスプレー法による scFv/Fab ライブラリー作製: 2,200,000
    抗原 (ペプチド-ビオチン化、蛋白質、低分子化合物―コンジュゲート)を供給いただき、免疫 (mice, rats, rabbits or chicken)、その後、リンパ球抽出、抗原-リンパ球コレクション、mRNA抽出、RT-PCRによるcDNA合成、scFv/Fab遺伝子特異的プライマーによるPCR、ファージベクターへのライゲーション、ライブラリー作製
  • ④バイオパニング: 1,650,000
    ②、③のライブラリーからsolution-sorting法によるバイオパニング (Binding Kinetics KD)、3-4ラウンド実施、ELISA後、最も結合力の強いバインダーの選定、シーケンス解析結果を提供
  • ⑤抗体作製: 570,000~
    バイオパニング後、抗体作製をお望みのお客様へRecombinant antibodyを提供
  • ②④、②④⑤、③④、③④⑤のいずれかを一括ご注文の場合は値引きがあります。

上記の料金は免疫抗原が1種類の場合の参考料金です。カクテル免疫の場合は、別料金となります。


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