qPCR(リアルタイムPCR)プローブ・プライマー合成

弊社が販売する試薬は全て研究用です。ページ内に記載されている料金等の金額は全て参考につき、詳細はお気軽にお問い合わせください。
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目次

可視光域から近赤外域までのクエンチャーと色素を様々に組み合わせたリアルタイムqPCRプローブとプライマーをご用意しています。また、6-FAM、HEX、TET修飾などの非IP色素やエキゾチック色素も提供しています。これらのプローブやプライマーは、天然のDNA塩基などを用いて様々なスケールで合成され、SNP検出、発現プロファイリング、in situハイブリダイゼーションなど、高親和性や高特異性のプローブを必要とする技術を向上させます。

PNA (Peptide Nucleic Acid)合成はこちら。

オリゴヌクレオチドの合成に30年以上の経験を持つバイオシンセシス社は、技術的に最も困難なプローブやプライマーを設計するための専門知識を有しています。当社の科学者は、世界中の研究者と協力して、新規の塩基アナログや標識を開発しています。バイオシンセシス社等によりどんなに複雑なお客様の仕様にも対応することができます。リアルタイムQPCRの設計や、特定のサーモサイクラーで使用する色素とクエンチャーの組み合わせの選択について、お困りのことがありましたら、お気軽にご相談ください。


qPCRプローブ概要

  • マルチラベルおよびミメティック塩基
  • 豊富なレポーターとクエンチャー
  • DNAやキメラ混合塩基
  • シングルまたはデュアルHPLCによる精製
  • MALDI、分析用HPLCおよびFluoroscanによるQC
  • 必要に応じて、凍結乾燥した状態でチューブなどに入れてお届けします。

定量的リアルタイムPCR (qPCR)は,PCR中に蓄積される増幅産物をリアルタイムで検出することに依存しております。反応の進行は、標的の濃度を検出するために、関連するレポーター分子からの蛍光の増加を追跡することによってモニターされます。qPCRアプリケーションで使用される蛍光追跡システムには、非特異的なDNA結合色素や配列特異的なプローブの使用があります。


オリゴヌクレオチド内の任意の位置に色素を標識することができます。第一級アミン修飾オリゴヌクレオチドを用いて、NHSコンジュゲーションケミストリーにより色素と共有結合させます。2回目のHPLC精製では、1回目のHPLC精製で失敗した配列を除去します。ラベル化後、2回目のHPLCで未ラベルのオリゴヌクレオチドと過剰な色素を除去し、完全長のラベル化オリゴヌクレオチドを得ます。
プローブを用いた検出方法は、2つのPCRプライマーの間に配置された1つまたは複数の蛍光標識オリゴヌクレオチドに依存します。プローブは配列特異的であるため、反応中の1つのアンプリコンの存在のみを検出します。使用できるプローブのデザインには、以下のような種類があります。

  • 二重標識されたプローブ
  • モレキュラービーコン
  • ライトサイクラー用プローブ、ハイブリダイゼーションFRETプローブ
  • スコーピオンズプローブ
  • プラクサープローブ

それぞれのプローブは、目的のアンプリコンのコピー数の増加に対応する蛍光シグナルの増加を測定することができます。配列特異的なプローブを使用することで感度が向上するだけでなく、これらのプローブは異なる蛍光色素で標識することができるため、同じPCR反応内で複数のターゲットを検出することができます。

  • 高い特異性
  • 1-10コピー程度の少ないコピー数でも感度が高い
  • 高い再現性
  • マルチプレックスや事前にデザインされたアッセイに適用可能
  • 高いレベルでの遺伝子発現の定量性

プローブベースのqPCR検出に使用されるアプリケーションは以下の通りです。

  • 遺伝子発現
  • DNAの定量化
  • CHiP (クロマチン免疫沈降)
  • SNPジェノタイピング
  • コピー数変動
  • パスウェイ解析
  • マイクロRNA & スモールRNA
  • 変異の検出
  • タンパク質解析
  • マルチプレックス

非特異的なDNA結合色素の検出

SYBR® Green IのようなDNA結合色素は、二本鎖DNAに非特異的に結合します。結合すると、色素は構造変化を起こし、高い蛍光発光を示します。この発光により、各増幅サイクル後に存在する二本鎖製品の総量を測定することができます。SYBR® Greenベースの検出は、以下のような利点があります。

  • 低コストで使いやすい
  • 中程度の特異性
  • 少ないコピー数での感度変化
  • 中程度の再現性
  • マルチプレックスには対応していません
  • 遺伝子発現の低レベルな定量

SYBRシステムを用いたアプリケーション

  • 遺伝子発現
  • DNAの定量 (病原体の検出)
  • CHiP (クロマチン免疫沈降)

qPCRプライマーデザイン

適切に最適化することで、qPCR反応の効率と感度を高めることができます。

プライマーとプローブの配置

一般的に、アンプリコンの長さは50~200塩基であることが望ましいとされています。RNAターゲットを定量する場合、cDNAサンプルに含まれる汚染されたゲノムDNAの増幅を避けるために、エクソン-エクソン結合部を含むプライマーを選択してください。

プライマーとプローブの濃度

プライマーとプローブの濃度を最適化することで、特定のアンプリコンの検出レベルを配列に応じて約10サイクル向上させることができます。アンプリコンの検出量が3Cq違うと、鋳型の濃度が約10倍違うことになるので、この簡単なステップで、反応の精度と感度の両方が大きく向上します。

バッファ条件

アッセイの性能は、バッファー成分(特にMgCl2)と内部参照色素の最適化によっても向上します。これらの成分の濃度を最適化することは、マルチプレックスアッセイや、適切なプローブとプライマーの組み合わせの設計が困難なシングルプレックスアッセイを設計する際に特に重要です。


バイオシンセシス社qPCRプローブの仕様

品質管理

全てのオリゴは、MALDI-TOF質量分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析 (ESI-MS)、キャピラリー電気泳動 (CE)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE)により品質を確認しています。

精製

完全に脱保護され、脱塩されています。PAGEまたはRP-HPLCによる精製

長さ

種類 Length
LightCycler probes 15 to 40 mers (optimal length: 20 to 30 mers)
Dual-labeled fluorogenic probes 15 to 40 mers
Molecular Beacons 15 to 40 mers
Scorpions probes 30 to 60 mers (uni-probe)
15 to 45 mers (bi-probe)
Plexor up to 30 mers

バックボーン

ホスホジエステル結合

フォーマット・輸送

乾燥した製品を不透明なチューブに入れて輸入・国内輸送されます。

参考納期

種類 Turn-around time
LightCycler probes 4 to 5 working days
Dual-labeled fluorogenic probes 5 to 6 working days
Molecular Beacons 5 to 6 working days
Scorpions probes 7 to 10 working days

ターンアラウンドタイムは、メーカー出荷までの期間であり、輸送時間は含まれていません。

テクニカルドキュメント

オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド名、配列、濃度、ODやnmolsでの正確な量、Tm、MW、長さ、消衰係数、精製データなどが記載されたOligonucleotide Technical Data Sheetとともにお届けします。

追加サービス

  • プローブデザインサービス
  • ハイスループットスクリーニングフォーマット (マイクロプレートなど)
  • アリコート

追加サービスにより納期が延びる場合があります。

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Generayによる合成での参考修飾料金

ご注意: 以下は修飾料金ですので、長さに応じ、基本合成料金がかかります。

Dual-Labeled DNA Probes
5′ 6-FAM – 3’TAMRA Yield(10-60base) 参考料金
G010-FT 2 ODs 16,000
G020-FT 5 ODs 21,400
G040-FT 10 ODs 32,000
G100-FT 20 ODs 48,000
5′ TET – 3’TAMRA Yield(10-60base) 参考料金
G010-TT 2 ODs 21,400
G020-TT 5 ODs 26,500
5′ HEX – 3’TAMRA Yield(10-60base) 参考料金
G010-HT 2 ODs 21,400
G020-HT 5 ODs 26,500
5′ JOE – 3’TAMRA Yield(10-60base) 参考料金
G010-JT 2 ODs 21,400
G020-JT 5 ODs 26,500
5′ 6-FAM – 3’BHQ1 Yield(10-60base) 参考料金
G010-FB 2 ODs 16,000
G020-FB 5 ODs 21,400
G040-FB 10 ODs 32,000
G100-FB 20 ODs 44,700
5′ TET – 3’BHQ1 Yield(10-60base) 参考料金
G010-TB 2 ODs 16,000
G020-TB 5 ODs 21,400
5′ HEX – 3’BHQ1 Yield(10-60base) 参考料金
G010-HB 2 ODs 16,000
G020-HB 5 ODs 21,400
5′ JOE – 3’BHQ1 Yield(10-60base) 参考料金
G010-JB 2 ODs 16,000
G020-JB 5 ODs 21,400
5’ROX – 3’BHQ-2 Yield(10-60base) 参考料金
G010-RB 2 ODs 21,400
G020-RB 5 ODs 28,500
5’CY3 – 3’BHQ-2 Yield(10-60base) 参考料金
G010-CY3B 2 ODs 26,700
G020-CY3B 5 ODs 40,000
5’CY5 – 3’BHQ-2 Yield(10-60base) 参考料金
G010-CY5B 2 ODs 26,700
G020-CY5B 5 ODs 40,000

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